Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Używasz wersji przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS.Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze).Ponadto, aby zapewnić stałe wsparcie, pokazujemy witrynę bez stylów i JavaScript.
Wyświetla jednocześnie karuzelę trzech slajdów.Użyj przycisków Wstecz i Dalej, aby przechodzić między trzema slajdami jednocześnie, lub użyj przycisków suwaków na końcu, aby przechodzić między trzema slajdami jednocześnie.
Wraz z rozwojem nowych ultramiękkich materiałów do urządzeń medycznych i zastosowań biomedycznych kompleksowa charakterystyka ich właściwości fizycznych i mechanicznych jest zarówno ważna, jak i trudna.Zmodyfikowana technika mikroskopii sił atomowych (AFM) została zastosowana do scharakteryzowania wyjątkowo niskiego modułu powierzchniowego nowej biomimetycznej silikonowo-hydrożelowej soczewki kontaktowej Lehfilcon, pokrytej warstwą rozgałęzionych struktur polimerowych.Metoda ta pozwala na precyzyjne wyznaczenie punktów styku bez efektu wytłaczania lepkiego przy zbliżaniu się do rozgałęzionych polimerów.Dodatkowo umożliwia określenie właściwości mechanicznych poszczególnych elementów szczotki bez efektu porowatości.Osiąga się to poprzez wybór sondy AFM o konstrukcji (rozmiar końcówki, geometria i sztywność), która jest szczególnie odpowiednia do pomiaru właściwości miękkich materiałów i próbek biologicznych.Ta metoda poprawia czułość i dokładność pomiaru bardzo miękkiego materiału lehfilcon A, który ma wyjątkowo niski moduł sprężystości na powierzchni (do 2 kPa) i wyjątkowo wysoką elastyczność w wewnętrznym (prawie 100%) środowisku wodnym .Wyniki badania powierzchni nie tylko ujawniły ultramiękkie właściwości powierzchni soczewki lehfilcon A, ale także pokazały, że moduł rozgałęzionych szczotek polimerowych był porównywalny z modułem podłoża krzemowo-wodorowego.Tę technikę charakteryzacji powierzchni można zastosować do innych ultramiękkich materiałów i urządzeń medycznych.
O właściwościach mechanicznych materiałów przeznaczonych do bezpośredniego kontaktu z żywą tkanką często decyduje środowisko biologiczne.Idealne dopasowanie tych właściwości materiału pozwala na osiągnięcie pożądanych właściwości klinicznych materiału bez powodowania niepożądanych odpowiedzi komórkowych1,2,3.W przypadku jednorodnych materiałów masowych charakterystyka właściwości mechanicznych jest stosunkowo łatwa ze względu na dostępność standardowych procedur i metod badawczych (np. mikrowgniecenia4,5,6).Jednak w przypadku ultramiękkich materiałów, takich jak żele, hydrożele, biopolimery, żywe komórki itp., te metody badawcze zasadniczo nie mają zastosowania ze względu na ograniczenia rozdzielczości pomiarów i niejednorodność niektórych materiałów7.Z biegiem lat tradycyjne metody wciskania były modyfikowane i dostosowywane do charakteryzowania szerokiej gamy miękkich materiałów, ale wiele metod nadal ma poważne wady, które ograniczają ich zastosowanie8,9,10,11,12,13.Brak specjalistycznych metod badawczych, które mogą dokładnie i wiarygodnie scharakteryzować właściwości mechaniczne supermiękkich materiałów i warstw powierzchniowych, poważnie ogranicza ich zastosowanie w różnych zastosowaniach.
W naszej poprzedniej pracy wprowadziliśmy soczewkę kontaktową lehfilcon A (CL), miękki heterogeniczny materiał o wszystkich właściwościach ultra miękkiej powierzchni pochodzących z potencjalnie biomimetycznych projektów inspirowanych powierzchnią rogówki oka.Ten biomateriał został opracowany poprzez szczepienie rozgałęzionej, usieciowanej warstwy polimerowej poli(2-metakryloiloksyetylofosforylocholiny (MPC)) (PMPC) na hydrożelu silikonowym (SiHy) 15 przeznaczonym do wyrobów medycznych na bazie.Ten proces szczepienia tworzy na powierzchni warstwę składającą się z bardzo miękkiej i wysoce elastycznej rozgałęzionej polimerowej struktury szczotki.Nasze wcześniejsze prace potwierdziły, że biomimetyczna struktura Lehfilcon A CL zapewnia doskonałe właściwości powierzchni, takie jak lepsze zapobieganie zwilżaniu i zarastaniu, zwiększona smarowność oraz zmniejszona adhezja komórek i bakterii15,16.Ponadto wykorzystanie i rozwój tego materiału biomimetycznego sugeruje również dalszą ekspansję na inne urządzenia biomedyczne.Dlatego niezwykle ważne jest scharakteryzowanie właściwości powierzchni tego ultramiękkiego materiału i zrozumienie jego mechanicznej interakcji z okiem, aby stworzyć obszerną bazę wiedzy wspierającą przyszły rozwój i zastosowania.Większość dostępnych na rynku soczewek kontaktowych SiHy składa się z jednorodnej mieszaniny hydrofilowych i hydrofobowych polimerów, które tworzą jednolitą strukturę materiału17.Przeprowadzono kilka badań w celu zbadania ich właściwości mechanicznych przy użyciu tradycyjnych metod testowania ściskania, rozciągania i mikrowgnieceń18,19,20,21.Jednak nowatorska konstrukcja biomimetyczna lehfilcon A CL sprawia, że ​​jest to unikalny materiał heterogeniczny, w którym właściwości mechaniczne rozgałęzionych struktur polimerowych znacznie różnią się od właściwości podłoża bazowego SiHy.Dlatego bardzo trudno jest dokładnie określić ilościowo te właściwości przy użyciu metod konwencjonalnych i wcięć.Obiecująca metoda wykorzystuje metodę testowania nanoindentacji zaimplementowaną w mikroskopii sił atomowych (AFM), metodę, która została wykorzystana do określenia właściwości mechanicznych miękkich materiałów lepkosprężystych, takich jak komórki i tkanki biologiczne, a także miękkich polimerów22,23,24,25 .,26,27,28,29,30.W nanoindentacji AFM podstawy testów nanoindentacji są połączone z najnowszymi postępami w technologii AFM, aby zapewnić zwiększoną czułość pomiaru i testowanie szerokiej gamy z natury supermiękkich materiałów31,32,33,34,35,36.Ponadto technologia oferuje inne ważne zalety dzięki zastosowaniu różnych geometrii.wgłębnik i sonda oraz możliwość testowania w różnych mediach płynnych.
Nanoindentację AFM można warunkowo podzielić na trzy główne komponenty: (1) sprzęt (czujniki, detektory, sondy itp.);(2) parametry pomiarowe (takie jak siła, przemieszczenie, prędkość, wielkość pochylni itp.);(3) Przetwarzanie danych (korekta linii bazowej, szacowanie punktów kontaktowych, dopasowanie danych, modelowanie itp.).Istotnym problemem związanym z tą metodą jest to, że kilka badań w literaturze wykorzystujących nanoindentację AFM podaje bardzo różne wyniki ilościowe dla tego samego typu próbki/ogniwa/materiału37,38,39,40,41.Na przykład Lekka i in.Zbadano i porównano wpływ geometrii sondy AFM na zmierzony moduł Younga próbek mechanicznie jednorodnych hydrożeli i komórek heterogenicznych.Podają, że wartości modułu są silnie zależne od wyboru wspornika i kształtu końcówki, z najwyższą wartością dla sondy w kształcie piramidy i najniższą wartością 42 dla sondy sferycznej.Podobnie Selhuber-Unkel i in.Pokazano, jak prędkość wgłębnika, rozmiar wgłębnika i grubość próbek poliakryloamidu (PAAM) wpływają na moduł Younga mierzony metodą nanoindentacji ACM43.Innym czynnikiem komplikującym jest brak standardowych materiałów testowych o bardzo niskim module i bezpłatnych procedur testowych.To sprawia, że ​​bardzo trudno jest uzyskać dokładne wyniki z pewnością.Jednak metoda ta jest bardzo przydatna do pomiarów względnych i ocen porównawczych między podobnymi typami próbek, na przykład przy użyciu nanoindentacji AFM w celu odróżnienia normalnych komórek od komórek nowotworowych 44, 45 .
Podczas testowania miękkich materiałów za pomocą nanoodcisku AFM ogólną zasadą jest stosowanie sondy o niskiej stałej sprężystości (k), która ściśle odpowiada modułowi próbki i półkulistej/okrągłej końcówce, tak aby pierwsza sonda nie przebiła powierzchni próbki na pierwszy kontakt z miękkimi materiałami.Istotne jest również, aby sygnał odchylenia generowany przez sondę był na tyle silny, aby mógł zostać wykryty przez system detektora laserowego24,34,46,47.W przypadku ultramiękkich heterogenicznych komórek, tkanek i żeli kolejnym wyzwaniem jest pokonanie siły przyczepności między sondą a powierzchnią próbki, aby zapewnić powtarzalne i wiarygodne pomiary48,49,50.Do niedawna większość prac nad nanoindentacją AFM koncentrowała się na badaniu mechanicznego zachowania komórek biologicznych, tkanek, żeli, hydrożeli i biomolekuł przy użyciu stosunkowo dużych sond sferycznych, powszechnie określanych jako sondy koloidalne (CP)., 47, 51, 52, 53, 54, 55. Te końcówki mają promień od 1 do 50 µm i są zwykle wykonane ze szkła borokrzemianowego, polimetakrylanu metylu (PMMA), polistyrenu (PS), dwutlenku krzemu (SiO2) i diamentu jak węgiel (DLC).Chociaż nanoindentacja CP-AFM jest często pierwszym wyborem do charakteryzowania miękkich próbek, ma ona swoje własne problemy i ograniczenia.Zastosowanie dużych, mikronowych końcówek sferycznych zwiększa całkowitą powierzchnię kontaktu końcówki z próbką i skutkuje znaczną utratą rozdzielczości przestrzennej.W przypadku próbek miękkich, niejednorodnych, gdzie właściwości mechaniczne lokalnych elementów mogą znacznie odbiegać od średniej na większym obszarze, wgniecenia CP mogą ukryć wszelkie niejednorodności właściwości w skali lokalnej52.Sondy koloidalne są zwykle wytwarzane przez przymocowanie koloidalnych kulek o wielkości mikrona do bezkońcówkowych wsporników za pomocą klejów epoksydowych.Sam proces produkcyjny jest obarczony wieloma problemami i może prowadzić do niespójności w procesie kalibracji sondy.Ponadto rozmiar i masa cząstek koloidalnych bezpośrednio wpływają na główne parametry kalibracji wspornika, takie jak częstotliwość rezonansowa, sztywność sprężyny i czułość na ugięcie56,57,58.Dlatego powszechnie stosowane metody konwencjonalnych sond AFM, takie jak kalibracja temperatury, mogą nie zapewniać dokładnej kalibracji CP, a do wykonania tych korekt mogą być wymagane inne metody57, 59, 60, 61. Typowe eksperymenty z wgłębieniami CP wykorzystują wspornik do dużych odchyleń badać właściwości miękkich próbek, co stwarza kolejny problem podczas kalibracji nieliniowego zachowania wspornika przy stosunkowo dużych odchyleniach62,63,64.Nowoczesne metody wciskania sondy koloidalnej zwykle uwzględniają geometrię wspornika użytego do kalibracji sondy, ale pomijają wpływ cząstek koloidalnych, co stwarza dodatkową niepewność co do dokładności metody38,61.Podobnie, moduły sprężystości obliczone przez dopasowanie modelu kontaktowego są bezpośrednio zależne od geometrii sondy wgłębnej, a niedopasowanie między końcówką a charakterystyką powierzchni próbki może prowadzić do niedokładności27,65,66,67,68. Niektóre ostatnie prace Spencera i in.Zwrócono uwagę na czynniki, które należy wziąć pod uwagę przy charakteryzowaniu miękkich szczoteczek polimerowych metodą nanoindentacji CP-AFM.Poinformowali, że zatrzymywanie lepkiego płynu w szczoteczkach polimerowych w funkcji prędkości powoduje wzrost obciążenia głowicy, a tym samym różne pomiary właściwości zależnych od prędkości30,69,70,71.
W tym badaniu scharakteryzowaliśmy moduł powierzchniowy ultramiękkiego, wysoce elastycznego materiału lehfilcon A CL, stosując zmodyfikowaną metodę nanoindentacji AFM.Biorąc pod uwagę właściwości i nową strukturę tego materiału, zakres czułości tradycyjnej metody wgłębnej jest wyraźnie niewystarczający do scharakteryzowania modułu tego niezwykle miękkiego materiału, dlatego konieczne jest zastosowanie metody nanoindentacji AFM o wyższej czułości i niższej czułości.poziom.Po zapoznaniu się z niedociągnięciami i problemami istniejących technik nanoindentacji sondy koloidalnej AFM, pokazujemy, dlaczego wybraliśmy mniejszą, specjalnie zaprojektowaną sondę AFM, aby wyeliminować czułość, szum tła, precyzyjny punkt styku, zmierzyć moduł prędkości miękkich materiałów niejednorodnych, takich jak zatrzymywanie płynów zależność.i dokładna kwantyfikacja.Ponadto byliśmy w stanie dokładnie zmierzyć kształt i wymiary końcówki wgłębienia, co pozwoliło nam wykorzystać model dopasowania stożka do kuli do określenia modułu sprężystości bez oceny powierzchni kontaktu końcówki z materiałem.Dwa domniemane założenia, które zostały określone ilościowo w tej pracy, to w pełni sprężyste właściwości materiału i moduł niezależny od głębokości wgniecenia.Korzystając z tej metody, najpierw przetestowaliśmy ultramiękkie wzorce o znanym module w celu ilościowego określenia metody, a następnie wykorzystaliśmy tę metodę do scharakteryzowania powierzchni dwóch różnych materiałów soczewek kontaktowych.Oczekuje się, że ta metoda charakteryzowania powierzchni nanoindentacji AFM o zwiększonej czułości będzie miała zastosowanie do szerokiej gamy biomimetycznych heterogenicznych ultramiękkich materiałów z potencjalnym zastosowaniem w urządzeniach medycznych i zastosowaniach biomedycznych.
Soczewki kontaktowe Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Teksas, USA) i ich podłoża silikonowo-hydrożelowe wybrano do eksperymentów nanoindentacji.W eksperymencie wykorzystano specjalnie zaprojektowane mocowanie obiektywu.Aby zainstalować obiektyw do testów, został on ostrożnie umieszczony na podstawce w kształcie kopuły, upewniając się, że do środka nie dostały się pęcherzyki powietrza, a następnie przymocowany krawędziami.Otwór w uchwycie w górnej części uchwytu obiektywu zapewnia dostęp do optycznego środka obiektywu w celu przeprowadzania eksperymentów nanoindentacji przy jednoczesnym utrzymywaniu cieczy w miejscu.Dzięki temu soczewki są w pełni nawilżone.Jako roztwór testowy zastosowano 500 μl roztworu do pakowania soczewek kontaktowych.Aby zweryfikować wyniki ilościowe, przygotowano dostępne w handlu hydrożele nieaktywowanego poliakryloamidu (PAAM) z kompozycji poliakryloamid-ko-metyleno-bisakryloamid (100 mm szalki Petrisoft Petri, Matrigen, Irvine, CA, USA), znany moduł sprężystości 1 kPa.Użyj 4-5 kropli (około 125 µl) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS z Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) i 1 kroplę płynu do soczewek kontaktowych OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, USA).) na interfejsie sondy hydrożelowej AFM.
Próbki podłoży Lehfilcon A CL i SiHy wizualizowano za pomocą systemu FEI Quanta 250 Field Emission Scanning Electron Microscope (FEG SEM) wyposażonego w detektor skaningowego transmisyjnego mikroskopu elektronowego (STEM).Aby przygotować próbki, soczewki najpierw przemyto wodą i pocięto na kliny w kształcie placka.Aby uzyskać zróżnicowany kontrast między hydrofilowymi i hydrofobowymi składnikami próbek, jako barwnika użyto 0,10% stabilizowanego roztworu RuO4, w którym próbki zanurzono na 30 min.Barwienie Lehfilcon A CL RuO4 jest ważne nie tylko dla uzyskania lepszego kontrastu różnicowego, ale także pomaga zachować strukturę rozgałęzionych szczoteczek polimerowych w ich oryginalnej formie, które są następnie widoczne na obrazach STEM.Następnie przemyto je i odwodniono w serii mieszanin etanol/woda o wzrastającym stężeniu etanolu.Następnie próbki odlano z żywicy epoksydowej EMBed 812/Araldite, która utwardzała się przez noc w temperaturze 70°C.Bloki próbek otrzymane w wyniku polimeryzacji żywicy pocięto ultramikrotomem, a otrzymane cienkie skrawki zwizualizowano za pomocą detektora STEM w trybie niskiej próżni przy napięciu przyspieszającym 30 kV.Ten sam system SEM zastosowano do szczegółowej charakterystyki sondy PFQNM-LC-A-CAL AFM (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA).Obrazy SEM sondy AFM uzyskano w typowym trybie wysokiej próżni z napięciem przyspieszającym 30 kV.Akwizycja obrazów pod różnymi kątami iw różnych powiększeniach pozwala rejestrować wszystkie szczegóły dotyczące kształtu i rozmiaru końcówki sondy AFM.Wszystkie wymiary końcówek będące przedmiotem zainteresowania na obrazach zostały zmierzone cyfrowo.
Mikroskop sił atomowych Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) z trybem „PeakForce QNM in Fluid” został użyty do wizualizacji i nanoindentacji lehfilcon A CL, substratu SiHy i próbek hydrożelu PAAm.Do eksperymentów obrazowania zastosowano sondę PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) o nominalnym promieniu końcówki 1 nm do przechwytywania obrazów próbki w wysokiej rozdzielczości przy szybkości skanowania 0, 50 Hz.Wszystkie zdjęcia wykonano w roztworze wodnym.
Eksperymenty z nanoindentacją AFM przeprowadzono przy użyciu sondy PFQNM-LC-A-CAL (Bruker).Sonda AFM ma silikonową końcówkę na wsporniku z azotku o grubości 345 nm, długości 54 µm i szerokości 4,5 µm z częstotliwością rezonansową 45 kHz.Jest specjalnie zaprojektowany do charakteryzowania i wykonywania ilościowych pomiarów nanomechanicznych na miękkich próbkach biologicznych.Czujniki są indywidualnie kalibrowane w fabryce ze wstępnie skalibrowanymi ustawieniami sprężyny.Stałe sprężystości sond użytych w tych badaniach mieściły się w zakresie 0,05–0,1 N/m.Aby dokładnie określić kształt i rozmiar końcówki, sondę szczegółowo scharakteryzowano za pomocą SEM.na ryc.Rysunek 1a przedstawia skaningową mikrografię elektronową o wysokiej rozdzielczości i niskim powiększeniu sondy PFQNM-LC-A-CAL, zapewniając całościowy widok konstrukcji sondy.na ryc.1b przedstawia powiększony widok wierzchołka końcówki sondy, dostarczający informacji o kształcie i rozmiarze końcówki.Na skrajnym końcu igła jest półkulą o średnicy około 140 nm (ryc. 1c).Poniżej tego wierzchołek zwęża się w kształt stożka, osiągając zmierzoną długość około 500 nm.Poza obszarem zwężenia końcówka jest cylindryczna i kończy się na całkowitej długości końcówki 1,18 µm.Jest to główna funkcjonalna część końcówki sondy.Ponadto do testowania jako sondy koloidalnej użyto również dużej kulistej sondy polistyrenowej (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) o średnicy końcówki 45 µm i stałej sprężystości 2 N/m.z sondą PFQNM-LC-A-CAL 140 nm dla porównania.
Donoszono, że ciecz może zostać uwięziona między sondą AFM a strukturą szczotki polimerowej podczas nanoindentacji, która będzie wywierać siłę skierowaną do góry na sondę AFM, zanim faktycznie dotknie ona powierzchni69.Ten lepki efekt wytłaczania spowodowany zatrzymaniem płynu może zmienić widoczny punkt styku, wpływając w ten sposób na pomiary modułu powierzchni.Aby zbadać wpływ geometrii sondy i szybkości wciskania na retencję płynu, wykreślono krzywe siły wciskania dla próbek Lehfilcon A CL przy użyciu sondy o średnicy 140 nm przy stałych szybkościach przemieszczania 1 µm/s i 2 µm/s.średnica sondy 45 µm, stałe ustawienie siły 6 nN osiągane przy 1 µm/s.Eksperymenty z sondą o średnicy 140 nm przeprowadzono przy prędkości wcięcia 1 µm/s i ustawionej sile 300 pN, dobranej tak, aby wytworzyć nacisk kontaktowy w zakresie fizjologicznym (1–8 kPa) górnej powieki.ciśnienie 72. Gotowe miękkie próbki hydrożelu PAA pod ciśnieniem 1 kPa badano na siłę wgniatania 50 pN przy prędkości 1 μm/s za pomocą sondy o średnicy 140 nm.
Ponieważ długość stożkowej części końcówki sondy PFQNM-LC-A-CAL wynosi około 500 nm, dla dowolnej głębokości wcięcia < 500 nm można bezpiecznie założyć, że geometria sondy podczas wciskania pozostanie wierna swojej w kształcie stożka.Ponadto zakłada się, że powierzchnia badanego materiału będzie wykazywała odwracalną odpowiedź sprężystą, co również zostanie potwierdzone w kolejnych podrozdziałach.Dlatego, w zależności od kształtu i rozmiaru końcówki, wybraliśmy model dopasowania stożka do kuli opracowany przez Briscoe, Sebastiana i Adamsa, który jest dostępny w oprogramowaniu dostawcy, do przetwarzania naszych eksperymentów nanoindentacji AFM (NanoScope).Oprogramowanie do analizy danych separacji, Bruker) 73. Model opisuje zależność siła-przemieszczenie F(δ) dla stożka z defektem kulistego wierzchołka.na ryc.Rysunek 2 przedstawia geometrię styku podczas interakcji sztywnego stożka z końcówką sferyczną, gdzie R to promień kulistej końcówki, a to promień styku, b to promień styku na końcu kulistej końcówki, δ to promień kontaktu.głębokość wcięcia, θ jest półkątem stożka.Obraz SEM tej sondy wyraźnie pokazuje, że sferyczna końcówka o średnicy 140 nm łączy się stycznie w stożek, więc tutaj b jest określone tylko przez R, tj. b = R cos θ.Oprogramowanie dostarczone przez dostawcę zapewnia zależność stożka od kuli w celu obliczenia wartości modułu Younga (E) na podstawie danych separacji sił przy założeniu a > b.Relacja:
gdzie F jest siłą wcięcia, E jest modułem Younga, v jest współczynnikiem Poissona.Promień kontaktu a można oszacować za pomocą:
Schemat geometrii kontaktu sztywnego stożka z kulistą końcówką wciśniętą w materiał soczewki kontaktowej Lefilcon z warstwą powierzchniową z rozgałęzionych szczoteczek polimerowych.
Jeśli a ≤ b, zależność sprowadza się do równania dla konwencjonalnego wgłębnika sferycznego;
Uważamy, że oddziaływanie sondy wcinającej z rozgałęzioną strukturą szczotki polimerowej PMPC spowoduje, że promień styku a będzie większy niż sferyczny promień styku b.Dlatego dla wszystkich pomiarów ilościowych modułu sprężystości wykonanych w niniejszej pracy wykorzystaliśmy zależność otrzymaną dla przypadku a > b.
Ultramiękkie materiały biomimetyczne badane w tym badaniu zostały kompleksowo zobrazowane za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM) przekroju poprzecznego próbki i mikroskopii sił atomowych (AFM) powierzchni.Ta szczegółowa charakterystyka powierzchni została przeprowadzona jako rozszerzenie naszej wcześniej opublikowanej pracy, w której ustaliliśmy, że dynamicznie rozgałęziona polimerowa struktura szczoteczki zmodyfikowanej PMPC powierzchni Lehfilcon A CL wykazuje podobne właściwości mechaniczne do naturalnej tkanki rogówki 14 .Z tego powodu powierzchnie soczewek kontaktowych nazywamy materiałami biomimetycznymi14.na ryc.3a, b przedstawiają przekroje poprzeczne rozgałęzionych struktur szczotek polimerowych PMPC na powierzchni odpowiednio podłoża Lehfilcon A CL i nietraktowanego podłoża SiHy.Powierzchnie obu próbek były dalej analizowane przy użyciu obrazów AFM o wysokiej rozdzielczości, co dodatkowo potwierdziło wyniki analizy STEM (ryc. 3c, d).Podsumowując, obrazy te dają przybliżoną długość rozgałęzionej struktury szczotki polimerowej PMPC przy 300–400 nm, co ma kluczowe znaczenie dla interpretacji pomiarów nanoindentacji AFM.Inną kluczową obserwacją wynikającą z obrazów jest to, że ogólna struktura powierzchni materiału biomimetycznego CL różni się morfologicznie od materiału podłoża SiHy.Ta różnica w morfologii ich powierzchni może stać się widoczna podczas ich interakcji mechanicznej z wcinającą się sondą AFM, a następnie w zmierzonych wartościach modułu.
Przekrojowe obrazy STEM (a) lehfilcon A CL i (b) podłoża SiHy.Pasek skali, 500 nm.Obrazy AFM powierzchni podłoża lehfilcon A CL ( c ) i podstawowego podłoża SiHy ( d ) (3 µm × 3 µm).
Bioinspirowane polimery i struktury szczotek polimerowych są z natury miękkie i były szeroko badane i stosowane w różnych zastosowaniach biomedycznych74,75,76,77.Dlatego ważne jest zastosowanie metody nanoindentacji AFM, która pozwala dokładnie i wiarygodnie zmierzyć ich właściwości mechaniczne.Ale jednocześnie wyjątkowe właściwości tych ultramiękkich materiałów, takie jak wyjątkowo niski moduł sprężystości, duża zawartość cieczy i wysoka elastyczność, często utrudniają dobór odpowiedniego materiału, kształtu i kształtu sondy wgłębnej.rozmiar.Jest to ważne, aby wgłębnik nie przebił miękkiej powierzchni próbki, co prowadziłoby do błędów w określeniu punktu styku z powierzchnią i obszaru styku.
W tym celu niezbędne jest kompleksowe zrozumienie morfologii ultramiękkich materiałów biomimetycznych (lehfilcon A CL).Uzyskane metodą obrazowania informacje o wielkości i strukturze rozgałęzionych szczotek polimerowych stanowią podstawę do mechanicznej charakterystyki powierzchni techniką nanoindentacji AFM.Zamiast sferycznych sond koloidalnych wielkości mikronów wybraliśmy sondę z azotku krzemu PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) o średnicy końcówki 140 nm, specjalnie zaprojektowaną do ilościowego mapowania właściwości mechanicznych próbek biologicznych 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84 Uzasadnienie stosowania stosunkowo ostrych sond w porównaniu z konwencjonalnymi sondami koloidalnymi można wyjaśnić cechami strukturalnymi materiału.Porównując rozmiar końcówki sondy (~ 140 nm) z rozgałęzionymi szczotkami polimerowymi na powierzchni CL lehfilcon A, pokazanymi na ryc. 3a, można stwierdzić, że końcówka jest wystarczająco duża, aby wejść w bezpośredni kontakt z tymi strukturami szczotkowymi, które zmniejsza ryzyko przebicia się przez nie końcówki.Aby zilustrować ten punkt, na ryc. 4 znajduje się obraz STEM lehfilcon A CL i wcinająca się końcówka sondy AFM (narysowana w skali).
Schemat przedstawiający obraz STEM lehfilcon A CL i sondy wgłębnej ACM (narysowany w skali).
Ponadto rozmiar końcówki wynoszący 140 nm jest wystarczająco mały, aby uniknąć ryzyka jakiegokolwiek efektu wytłaczania lepkości, o którym wcześniej informowano w przypadku szczotek polimerowych wytwarzanych metodą nanoindentacji CP-AFM69,71.Zakładamy, że ze względu na specjalny stożkowo-sferyczny kształt i stosunkowo mały rozmiar tej końcówki AFM (rys. 1), charakter krzywej siły generowanej przez lehfilcon A CL nanoindentation nie będzie zależał od prędkości wciskania ani prędkości ładowania/rozładowywania .Dlatego nie podlega efektom poroelastycznym.Aby przetestować tę hipotezę, próbki Lehfilcon A CL zostały wgniecione przy ustalonej maksymalnej sile za pomocą sondy PFQNM-LC-A-CAL, ale przy dwóch różnych prędkościach, a otrzymane krzywe siły rozciągania i powrotu wykorzystano do wykreślenia siły (nN) w separacji (µm) pokazano na rysunku 5a.Oczywiste jest, że krzywe sił podczas obciążania i rozładowywania całkowicie się pokrywają i nie ma jednoznacznych dowodów na to, że siła ścinająca przy zerowej głębokości wgniecenia wzrasta wraz z prędkością wcięcia na rysunku, co sugeruje, że poszczególne elementy szczotki zostały scharakteryzowane bez efektu poroelastycznego.W przeciwieństwie do tego, efekty zatrzymywania płynów (efekty lepkiego wytłaczania i porowatości) są widoczne dla sondy AFM o średnicy 45 µm przy tej samej prędkości wcięcia i są uwydatnione przez histerezę między krzywymi rozciągania i cofania, jak pokazano na rycinie 5b.Wyniki te potwierdzają hipotezę i sugerują, że sondy o średnicy 140 nm są dobrym wyborem do charakteryzowania takich miękkich powierzchni.
lehfilcon A CL krzywe siły wgniatania przy użyciu ACM;(a) przy użyciu sondy o średnicy 140 nm przy dwóch prędkościach obciążenia, wykazując brak efektu poroelastycznego podczas wgniatania powierzchni;(b) przy użyciu sond o średnicy 45 µm i 140 nm.s pokazują wpływ lepkiego wytłaczania i porowatości dla dużych sond w porównaniu z mniejszymi sondami.
Aby scharakteryzować ultramiękkie powierzchnie, metody nanoindentacji AFM muszą mieć najlepszą sondę do badania właściwości badanego materiału.Oprócz kształtu i rozmiaru końcówki, czułość systemu detektora AFM, czułość na ugięcie końcówki w środowisku testowym oraz sztywność wspornika odgrywają ważną rolę w określaniu dokładności i niezawodności nanoindentacji.pomiary.W przypadku naszego systemu AFM granica wykrywalności detektora położenia czułego (PSD) wynosi około 0,5 mV i jest oparta na wstępnie skalibrowanej sztywności sprężyny oraz obliczonej czułości ugięcia płynu sondy PFQNM-LC-A-CAL, która odpowiada Teoretyczna czułość obciążenia.jest mniejsza niż 0,1 pN.Dlatego ta metoda pozwala na pomiar minimalnej siły wciskania ≤ 0,1 pN bez jakiejkolwiek składowej szumu obwodowego.Jednak jest prawie niemożliwe, aby system AFM zredukował hałas peryferyjny do tego poziomu ze względu na takie czynniki, jak wibracje mechaniczne i dynamika płynów.Czynniki te ograniczają ogólną czułość metody nanoindentacji AFM, a także powodują sygnał szumu tła o wartości około ≤ 10 pN.W celu scharakteryzowania powierzchni próbki substratów Lehfilcon A CL i SiHy wcięto w warunkach pełnego uwodnienia przy użyciu sondy 140 nm do charakteryzacji SEM, a otrzymane krzywe siły nałożono na siłę (pN) i ciśnienie.Wykres rozdziału (µm) pokazano na rycinie 6a.W porównaniu z podłożem bazowym SiHy, krzywa siły Lehfilcon A CL wyraźnie pokazuje fazę przejściową rozpoczynającą się w punkcie kontaktu z rozwidloną szczotką polimerową i kończącą się ostrą zmianą nachylenia oznaczającą kontakt końcówki z materiałem pod spodem.Ta przejściowa część krzywej siły podkreśla prawdziwie elastyczne zachowanie rozgałęzionej szczotki polimerowej na powierzchni, o czym świadczy krzywa ściskania ściśle zgodna z krzywą naprężenia oraz kontrast we właściwościach mechanicznych między strukturą szczotki a nieporęcznym materiałem SiHy.Porównując lefilcon.Oddzielenie średniej długości rozgałęzionej szczotki polimerowej na obrazie STEM PCS (ryc. 3a) i jego krzywej siły wzdłuż odciętej na ryc. 3a.6a pokazuje, że metoda jest w stanie wykryć końcówkę i rozgałęziony polimer docierający do samego wierzchołka powierzchni.Kontakt między strukturami szczotek.Ponadto bliskie zachodzenie na siebie krzywych siły wskazuje na brak efektu retencji cieczy.W tym przypadku nie ma absolutnie żadnego przylegania między igłą a powierzchnią próbki.Najwyższe sekcje krzywych siły dla dwóch próbek zachodzą na siebie, odzwierciedlając podobieństwo właściwości mechanicznych materiałów podłoża.
( a ) krzywe siły nanoindentacji AFM dla podłoży lehfilcon A CL i podłoży SiHy, ( b ) krzywe siły przedstawiające oszacowanie punktu styku przy użyciu metody progu szumu tła.
W celu zbadania drobniejszych szczegółów krzywej siły, krzywą naprężenia próbki Lehfilcon A CL ponownie wykreślono na ryc. 6b z maksymalną siłą 50 pN wzdłuż osi y.Ten wykres zawiera ważne informacje na temat oryginalnego szumu tła.Szum mieści się w zakresie ±10 pN, co służy do dokładnego określenia punktu styku i obliczenia głębokości wcięcia.Jak podano w literaturze, identyfikacja punktów kontaktowych ma kluczowe znaczenie dla dokładnej oceny właściwości materiału, takich jak moduł85.Podejście polegające na automatycznym przetwarzaniu danych krzywej siły wykazało lepsze dopasowanie między dopasowaniem danych a pomiarami ilościowymi dla miękkich materiałów86.W tej pracy nasz wybór punktów styku jest stosunkowo prosty i obiektywny, ale ma swoje ograniczenia.Nasze konserwatywne podejście do wyznaczania punktu styku może skutkować nieco przeszacowanymi wartościami modułu dla mniejszych głębokości wcięcia (< 100 nm).Wykorzystanie opartego na algorytmie wykrywania punktów styku i automatycznego przetwarzania danych może być kontynuacją tych prac w przyszłości w celu dalszego doskonalenia naszej metody.Zatem dla wewnętrznego szumu tła rzędu ± 10 pN definiujemy punkt kontaktu jako pierwszy punkt danych na osi x na rysunku 6b o wartości ≥ 10 pN.Następnie, zgodnie z progiem szumu 10 pN, pionowa linia na poziomie ~0,27 µm wyznacza punkt styku z powierzchnią, po czym krzywa rozciągania jest kontynuowana, aż podłoże osiągnie głębokość wgniecenia ~270 nm.Co ciekawe, na podstawie wielkości rozgałęzionych cech szczoteczki polimerowej (300–400 nm) zmierzonej metodą obrazowania, głębokość wcięcia próbki CL lehfilcon A obserwowana metodą progu szumu tła wynosi około 270 nm, co jest bardzo bliskie rozmiar pomiaru za pomocą STEM.Wyniki te dodatkowo potwierdzają kompatybilność i przydatność kształtu i rozmiaru końcówki sondy AFM do wciskania tej bardzo miękkiej i wysoce elastycznej rozgałęzionej struktury szczotki polimerowej.Dane te dostarczają również mocnych dowodów na poparcie naszej metody wykorzystywania szumu tła jako progu do określania punktów kontaktowych.Zatem wszelkie wyniki ilościowe uzyskane z modelowania matematycznego i dopasowania krzywej siły powinny być stosunkowo dokładne.
Pomiary ilościowe metodami nanoindentacji AFM są całkowicie zależne od modeli matematycznych wykorzystywanych do selekcji danych i późniejszej analizy.Dlatego ważne jest, aby przed wyborem konkretnego modelu wziąć pod uwagę wszystkie czynniki związane z wyborem wgłębnika, właściwościami materiału oraz mechaniką ich interakcji.W tym przypadku geometrię końcówki dokładnie scharakteryzowano za pomocą mikrografii SEM (ryc. 1) i na podstawie wyników nanoindentingowa sonda AFM o średnicy 140 nm z twardym stożkiem i sferyczną geometrią końcówki jest dobrym wyborem do charakteryzowania próbek lehfilcon A CL79 .Innym ważnym czynnikiem, który należy dokładnie ocenić, jest elastyczność badanego materiału polimerowego.Chociaż wstępne dane nanoindentacji (rys. 5a i 6a) wyraźnie zarysowują cechy nakładania się krzywych rozciągania i ściskania, czyli całkowitego powrotu elastycznego materiału, niezwykle ważne jest potwierdzenie czysto sprężystego charakteru styków .W tym celu wykonano dwa kolejne nacięcia w tym samym miejscu na powierzchni próbki lehfilcon A CL z szybkością nacięć 1 µm/sw warunkach pełnej hydratacji.Wynikowe dane krzywej siły pokazano na ryc.7 i zgodnie z oczekiwaniami krzywe rozszerzania i kompresji dwóch odcisków są prawie identyczne, co podkreśla wysoką elastyczność rozgałęzionej struktury pędzla polimerowego.
Dwie krzywe siły wcięcia w tym samym miejscu na powierzchni lehfilcon A CL wskazują idealną elastyczność powierzchni soczewki.
Na podstawie informacji uzyskanych z obrazów SEM i STEM odpowiednio końcówki sondy i powierzchni lehfilcon A CL, model stożka-sfery jest rozsądnym matematycznym przedstawieniem interakcji między końcówką sondy AFM a badanym miękkim materiałem polimerowym.Ponadto w przypadku tego modelu stożkowo-sfery podstawowe założenia dotyczące właściwości sprężystych odciśniętego materiału są prawdziwe dla tego nowego materiału biomimetycznego i są wykorzystywane do ilościowego określenia modułu sprężystości.
Po kompleksowej ocenie metody nanoindentacji AFM i jej składników, w tym właściwości sondy wgłębnej (kształt, rozmiar i sztywność sprężyny), czułości (szum tła i oszacowanie punktu styku) oraz modeli dopasowania danych (ilościowe pomiary modułu), metoda została używany.scharakteryzować dostępne w handlu ultramiękkie próbki, aby zweryfikować wyniki ilościowe.Dostępny w handlu hydrożel poliakryloamidowy (PAAM) o module sprężystości 1 kPa badano w warunkach uwodnienia za pomocą sondy 140 nm.Szczegóły dotyczące testowania modułów i obliczeń znajdują się w informacjach uzupełniających.Wyniki pokazały, że średni zmierzony moduł wyniósł 0,92 kPa, a %RSD i procentowe (%) odchylenie od znanego modułu były mniejsze niż 10%.Wyniki te potwierdzają dokładność i powtarzalność metody nanoindentacji AFM zastosowanej w tej pracy do pomiaru modułów ultramiękkich materiałów.Powierzchnie próbek lehfilcon A CL i podstawowe podłoże SiHy scharakteryzowano dalej przy użyciu tej samej metody nanoindentacji AFM w celu zbadania pozornego modułu kontaktowego ultramiękkiej powierzchni w funkcji głębokości wgniecenia.Krzywe rozdzielania siły wgniecenia zostały wygenerowane dla trzech próbek każdego typu (n = 3; jedno wgniecenie na próbkę) przy sile 300 pN, prędkości 1 µm/s i pełnym uwodnieniu.Krzywa rozkładu siły wgniatania została przybliżona za pomocą modelu stożka-sfery.Aby uzyskać moduł zależny od głębokości wcięcia, część krzywej siły o szerokości 40 nm została ustawiona w każdym kroku 20 nm, zaczynając od punktu styku, i zmierzono wartości modułu na każdym kroku krzywej siły.Spin Cy i in.Podobne podejście zastosowano do scharakteryzowania gradientu modułu szczotek polimerowych z poli(metakrylanu laurylu) (P12MA) przy użyciu nanoindentacji sondy koloidalnej AFM i są one zgodne z danymi przy użyciu modelu kontaktowego Hertza.To podejście zapewnia wykres pozornego modułu styku (kPa) w funkcji głębokości wgniecenia (nm), jak pokazano na rysunku 8, który ilustruje pozorny moduł styku/gradient głębokości.Obliczony moduł sprężystości próbki CL lehfilcon A mieści się w zakresie 2–3 kPa w obrębie górnych 100 nm próbki, powyżej której zaczyna rosnąć wraz z głębokością.Z drugiej strony, podczas badania podłoża bazowego SiHy bez pędzlowego filmu na powierzchni, maksymalna głębokość wcięcia osiągnięta przy sile 300 pN jest mniejsza niż 50 nm, a wartość modułu uzyskana z danych wynosi około 400 kPa , co jest porównywalne z wartościami modułu Younga dla materiałów sypkich.
Pozorny moduł kontaktowy (kPa) w funkcji głębokości wcięcia (nm) dla podłoży Lehfilcon A CL i SiHy przy użyciu metody nanoindentacji AFM z geometrią stożkowo-sferyczną do pomiaru modułu.
Najwyższa powierzchnia nowej biomimetycznej rozgałęzionej struktury szczotki polimerowej wykazuje wyjątkowo niski moduł sprężystości (2–3 kPa).Będzie to pasować do swobodnie wiszącego końca rozwidlonej szczotki polimerowej, jak pokazano na obrazie STEM.Chociaż istnieją pewne dowody na gradient modułu na zewnętrznej krawędzi CL, główny substrat o wysokim module ma większy wpływ.Jednak górne 100 nm powierzchni mieści się w granicach 20% całkowitej długości rozgałęzionej szczotki polimerowej, więc zasadne jest założenie, że zmierzone wartości modułu w tym zakresie głębokości wcięcia są stosunkowo dokładne i nie silnie zależą od efektu dolnego obiektu.
Ze względu na unikalną konstrukcję biomimetyczną soczewek kontaktowych lehfilcon A, składających się z rozgałęzionych struktur szczoteczek polimerowych PMPC szczepionych na powierzchni podłoży SiHy, bardzo trudno jest wiarygodnie scharakteryzować właściwości mechaniczne ich struktur powierzchniowych przy użyciu tradycyjnych metod pomiarowych.Tutaj przedstawiamy zaawansowaną metodę nanoindentacji AFM do dokładnego charakteryzowania ultramiękkich materiałów, takich jak lefilcon A, o wysokiej zawartości wody i wyjątkowo wysokiej elastyczności.Ta metoda opiera się na zastosowaniu sondy AFM, której rozmiar i geometria końcówki są starannie dobrane, aby pasowały do ​​​​wymiarów strukturalnych ultramiękkich cech powierzchni, które mają być odciśnięte.Ta kombinacja wymiarów między sondą a strukturą zapewnia zwiększoną czułość, co pozwala nam mierzyć niski moduł i nieodłączne właściwości sprężyste rozgałęzionych polimerowych elementów szczotkowych, niezależnie od efektów poroelastycznych.Wyniki pokazały, że unikalne rozgałęzione szczotki polimerowe PMPC charakterystyczne dla powierzchni soczewki miały wyjątkowo niski moduł sprężystości (do 2 kPa) i bardzo wysoką elastyczność (prawie 100%) podczas testów w środowisku wodnym.Wyniki nanoindentacji AFM pozwoliły nam również scharakteryzować pozorny moduł kontaktu / gradient głębokości (30 kPa / 200 nm) powierzchni soczewki biomimetycznej.Ten gradient może wynikać z różnicy modułów między rozgałęzionymi szczotkami polimerowymi a podłożem SiHy lub rozgałęzionej struktury/gęstości szczotek polimerowych lub ich kombinacji.Jednak potrzebne są dalsze dogłębne badania, aby w pełni zrozumieć związek między strukturą a właściwościami, zwłaszcza wpływ rozgałęzień szczotek na właściwości mechaniczne.Podobne pomiary mogą pomóc scharakteryzować właściwości mechaniczne powierzchni innych ultramiękkich materiałów i urządzeń medycznych.
Zbiory danych wygenerowane i/lub przeanalizowane podczas bieżącego badania są dostępne u odpowiednich autorów na uzasadnione żądanie.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. i Haugen, HJ Biologiczne reakcje na fizyczne i chemiczne właściwości powierzchni biomateriałów.Chemiczny.społeczeństwo.wyd.49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM i Liu, X. Ulepszenie biomateriałów pochodzenia ludzkiego do inżynierii tkankowej.programowanie.polimer.nauka.53, 86 (2016).
Sadtler, K. i in.Projektowanie, wdrażanie kliniczne i odpowiedź immunologiczna biomateriałów w medycynie regeneracyjnej.National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK i Farr GM Udoskonalona metoda określania twardości i modułu sprężystości za pomocą eksperymentów wgłębnych z pomiarami obciążenia i przemieszczenia.J. Alma Mater.Zbiornik.7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Historyczne początki badań twardości metodą wciskania.Alma Mater.nauka.technologie.28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Pomiary twardości wgnieceń w makro-, mikro- i nanoskali: krytyczny przegląd.plemię.Wrighta.65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD i Clapperich, SM Błędy wykrywania powierzchni prowadzą do przeszacowania modułu w nanoindentacji miękkich materiałów.J. Mecha.Zachowanie.Nauka biomedyczna.Alma Mater.2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR i Yahya M.Yu.Ocena metody nanoindentacji do wyznaczania właściwości mechanicznych heterogenicznych nanokompozytów metodami doświadczalnymi i obliczeniowymi.nauka.Dom 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR i Owart, TS Mechaniczna charakterystyka miękkich lepkosprężystych żeli za pomocą analizy odwrotnych elementów skończonych opartej na wcięciach i optymalizacji.J. Mecha.Zachowanie.Nauka biomedyczna.Alma Mater.2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J i Chaneler D. Optymalizacja wyznaczania lepkosprężystości za pomocą kompatybilnych systemów pomiarowych.Miękka materia 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. i Pellillo, E. Nanoindentacja powierzchni polimerowych.J. Fizyka.D. Ubiegaj się o fizykę.31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. i Van Vliet KJ Charakterystyka lepkosprężystych właściwości mechanicznych wysokoelastycznych polimerów i tkanek biologicznych za pomocą uderzenia uderzeniowego.Dziennik biomateriałów .71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Ocena modułu sprężystości i pracy adhezyjnej materiałów miękkich za pomocą rozszerzonej metody Borodicha-Galanova (BG) i głębokiego wcięcia.futro.Alma Mater.129, 198–213 (2019).
Shi, X. i in.Morfologia i właściwości mechaniczne biomimetycznych powierzchni polimerowych silikonowo-hydrożelowych soczewek kontaktowych w nanoskali.Langmuir 37, 13961–13967 (2021).